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靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動
Annexin V-RFP 細胞凋亡檢測試劑盒 ?用戶手冊

產品簡介:

  • 細胞凋亡普遍存在于生物界,是細胞的基本特征之一,對胚胎發育及形態發生、組織修復、內環境的穩定、機體的防御和免疫反應等方面都起到十分重要的作用。

  • AnnexinV-RFP細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-RFP Apoptosis Detection Kit)是用RFP融合的重組人AnnexinV來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的磷酯酰絲氨酸的一種細胞凋亡檢測試劑盒。可以使用流式細胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測設備進行檢測。AnnexinV是一種分子量為35.8kDCa2+依賴性磷脂結合蛋白,廣泛分布于真核細胞胞漿內,參與細胞信號轉導。AnnexinV 能與磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine,簡稱PS)高親和性特異地結合。在正常細胞中,PS主要分布在細胞膜內側,在細胞發生凋亡的早期,細胞膜上的PS會外翻到細胞表面。用帶有紅色熒光的AnnexinV-RFP標識出凋亡細胞。

  • 本試劑盒檢測的是紅色熒光,因此在待檢測的細胞已經表達GFP等綠色熒光蛋白的情況下,特別適合使用本試劑盒檢測細胞凋亡。

產品包裝:

產品貨號

產品規格

包裝內容

Annexin  V-RFP1×Binding  Buffer

CD004-1

5 assays

25ul

2ml

CD004-2

25 assays

125ul

10ml

CD004-3

200 assays

1ml

80ml

CD004-4

1000  assays

200ml

400ml


保存條件:

4℃保存,AnnexinV-RFP 染色液需避光保存,半年有效。若長期保存,結合液可以-20℃保存。


需自備的試劑及儀器:

  • PBS

  • 蒸餾水或去離子水水平離心機

  • 流式細胞儀或熒光顯微鏡移液器

使用說明:

A.樣品準備

1A.對于懸浮細胞,在進行完細胞凋亡刺激后,1000g離心 5分鐘。

1B.對于貼壁細胞,把細胞培養液吸出至合適離心管內(內含已經懸浮的發生凋亡或壞

死的細胞),PBS 洗滌貼壁細胞一次,加入適量胰酶消化細胞。室溫孵育至輕輕吹

打可以使細胞吹打下來時,吸除胰酶,避免胰酶消化不夠或消化過度。加入收集的

細胞培養液,輕輕吹打均勻,轉移到離心管內,1000g 離心 5 分鐘。

注意:中晚期凋亡細胞因失去貼壁能力而懸浮于上清中,此部分細胞對于結果是否顯著具有重大影響,不可任意丟棄,需離心收集后一起檢測才能全面反映出細胞凋亡的整體情況。

注意:胰酶消化時細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

2.棄上清,用 1ml PBS 輕輕重懸細胞并計數(不少于105),然后 1000g 離心5 分鐘收集細胞。

注意:PBS 洗滌細胞,洗掉殘留的胰酶,否則殘留的胰酶會消化并降解 Annexin V-

RFP,最終導致染色失敗。

3.加入 400μl1×Binding Buffer 輕輕重懸細胞。

4.加入 5μlAnnexin V-RFP,輕輕混勻,室溫避光孵育 15 分鐘。

5.在 30 分鐘內進行流式細胞儀檢測,AnnexinV-RFP 為紅色熒光。

6.如果用熒光顯微鏡下檢測,則 1000g 離心5 分鐘,收集細胞,用 50-100μl 1×Binding Buffer 輕輕重懸細胞,涂片后,熒光顯微鏡下觀察。

B.流式細胞儀分析

  • 流式細胞儀激發光采用激發波長 545nm,發射波長>575 nm 檢測RFP。Annexin V-RFP的紅色熒光通過RFP 通道(FL2)檢測。細胞應可分成三個亞群:正常活細胞僅有很低的熒光強度,凋亡和壞死細胞有較強的紅色熒光。如果要進一步區分凋亡和壞死細胞,可以使用其他細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測。

  • 使用流式細胞儀正確分析 Annexin V-RFP 染色的細胞前要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發光之間的疊加,不同儀器之間的補償不同。因此需要設置未處理細胞空白對照和經 Annexin V-RFP 單染的細胞、本身表達其他熒光(如GFP)的 3 個對照樣本來調整熒光補償去除光譜重疊。根據對上述 3 個對照的分析設定十字門的位置。補償樣品上機及調整細則如下:

  1. 上樣未經染色的細胞,在線性 FS-SS 點圖上顯示細胞并設門圈出目標細胞群體,選定有效事件區域。建立FL1-FL2 雙參數點圖并分析以上散點圖中設門的細胞,保證>98%的細胞處于在X、Y軸Log1 為邊界的左下象限中心區域。

  2. 檢測 Annexin V-RFP 單染的細胞并檢查FL1-FL2 散點圖,保證在左上和右上象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在上端象限則說明有熒光滲漏;需降低 FL1PMT 的電壓,以有效地去除FL2 的陽性信號。

  3. 檢測僅表達如 GFP 熒光的細胞并檢查 FL1-FL2 散點圖,保證在右上和右下象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在右側象限則說明有熒光滲漏,需降低FL2 PMT 的電壓,以有效地去除 FL2 的陽性信號。

  4. 如果在以上調節補償過程中更改了 PMT 的電壓,建議重復2、3步驟。

注意事項:

  • 該試劑盒只能檢測活細胞,而不能用于切片、擦刮、固定或浸潤細胞樣品的檢測。細胞凋亡是一種持續變化的動態過程,選擇合適的誘導時間對觀察凋亡比較重要。

  • 染色后宜盡快檢測,時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數量增加。如果有細菌或真菌污染,會嚴重影響檢測效果。

  • PBS洗滌細胞,洗掉殘留的胰酶,否則殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-RFP,最終導致染色失敗。

  • 熒光物質均易發生淬滅,在進行熒光觀察時,盡量縮短觀察時間,同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

  • 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

  • 檢測血液樣品時,如果含有血小板,請使用含有 EDTA 的緩沖劑并 200×g 離心洗去血小板。因為血小板含有 PS,能與 Annexin V 結合,從而干擾實驗結果。旋蓋離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心,避免開蓋時液體灑落。

  • AnnexinV-RFP是光敏物質,在操作時請注意避光。

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