銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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siRNA的細胞轉染及篩選

Cell transfection and screening



實驗原理


繼植物中發現基因沉默現象后,動物細胞中的雙鏈RNA誘導的基因沉默現象也被闡明,并于2006年獲得諾貝爾醫學獎的肯定,足以說明RNAi技術在醫學領域即將發揮的開創性作用。siRNA(Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer酶加工雙鏈RNA而成。siRNA與體內多種酶類結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC),從而激發與之互補的目標mRNA的降解。天然的RNAi現象存在于包括人類在內的動植物體內,在調節基因表達和預防病毒感染方面起到重要作用。


技術應用


基因功能的體內外研究

RNAi類藥物研發


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

靶細胞

目的基因NCBI登陸號、靶細胞培養條件

4周

我們提供

剩余siRNA

基本實驗步驟、細胞照片、 qPCR原始數據,擴增曲線,熔解曲線


實驗結果展示


   圖1 相對定量 PCR 檢測 3 組 siRNA 轉染組相對陰性對照組目的基因的干擾效果


TROUBLESHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

熒光標記的陰性對照siRNA無可見熒光?

轉染效率不高

保證細胞狀態良好;選擇合適的轉染試劑,調整轉染試劑siRNA的比例;避免培養基中含有抗生素;適當延長觀察時間。

siRNA轉染實驗陽性對照和靶基因均無干擾效果?

轉染體系

提高轉染效率,模式siRNA的使用濃度,注意實驗操作防止RNA每污染。

陽性對照有效而靶基因的siRNA轉染無干擾效果?

干擾靶點無效

設計多對siRNA片段進行嘗試,選擇干擾效率最高的靶點。

同一對siRNA在不同細胞中干擾效果不同?

不同細胞特性不同

轉染效率相近,不同細胞核酸酶的活性高低也會影響siRNA的代謝速度,導致沉默效果出現差異。

本底表達豐度不同

本底表達豐度很高或很低對干擾效果都有影響。

轉染效率不同

優化轉染方式,提高轉染效率。


常見問題FAQ


Q:化學合成siRNA的結構?

A:化學合成的siRNA為正義鏈和反義鏈雙鏈結構,正義鏈與靶序列相同,通常為19個核苷酸。另外正義鏈和反義鏈的3‘端均含有dTd的懸垂,脫氧核糖核苷可保護siRNA免受降解。客戶未有驗證靶點的情況下建議一次合成3對以上的siRNA進行篩選工作。


Q :化學合成的siRNA有哪些可選種類?特點有哪些?

種類

特點

化學合成siRNA

無修飾和熒光標記,合成方便快捷,價格便宜。

化學修飾siRNA

對正義鏈進行化學修飾更加穩定,延長了作用時間。

熒光標記siRNA

對正義鏈進行熒光標記(如CYC3)后可通過觀察熒光優化轉染條件,也便于對siRNA進行定位追蹤。


Q:細胞轉染實驗的siRNA推薦濃度是多少?

A:細胞轉染實驗的終濃度建議采用50-100NM,濃度過高導致細胞毒性。對于21bp的siRNAoligo,有如下簡單關系:20D=6.0nmol=80ug。一般購買20D包裝的siRNA,可采用DEPC水配成母液后使用前稀釋。


Q:實驗中采用陰性對照和陽性對照siRNA的目的?

A:由于高濃度的siRNA有可能導致非常異性的干擾結果,因此必須設置陰性對照,建議使用通過的帶有熒光標記的陰性對照siRNA;將靶序列打亂之后的陰性對照siRNA,未經驗證,有可能引起off-target現象。陽性對照可以確保實驗中的操作無誤,如轉染操作,RNA抽提方法以及qPCR檢測結果都是可信的。


Q:化學合成的siRNA靶點序列將來可否用于構建shRNA質粒載體和病毒包裝?

A:已確認干擾效果的siRNA靶點可以進行shRNA質粒載體的構建個病毒包裝工作,但畢竟表達體系不同可能存在一定的風險,干擾效果會有一定的差異。建議構建好shRNA質粒載體后進行干擾效果的驗證工作。


參考文獻

1.Paul CP, Good PD Winer l Effectie expression of small interfering R NA in human cells. Nature Biotechnology2002,20(5):505-508.

2.Ladunga I. More complete gene silencing by fewer siR NAs: transparent optimized design and biophysical signatuse. Nucleic Res 2007,35(2):433-440.

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