銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

臨床醫學創新,轉化造福患者

動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

聯系電話:

021-80158420

甲基化檢測

Methylation detection



實驗原理


DNA甲基化存在于大多數真核生物中,一般發生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶的5’UTR區,起調控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化,20%處于基因調控區的CpG島中。BSP甲基化測序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR)的原理通過對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理,非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉變成尿嘧啶,在隨后的PCR反應中尿嘧啶轉變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脫氨基,在反應完成時被保留(見圖5.1),我們將擴增得到的PCR產物進行TA克隆測序,就可以分析甲基化發生的具體情況。該方法實驗結果準確性高,是甲基化檢測的金標準。


QQ圖片1.png

圖5.1BSP甲基化檢測示意圖


技術應用


通過對疾病及正常對照樣本的靶基因進行甲基化分析,在研究腫瘤發生機制及早期診斷等方面均具有重要的臨床意義。


實驗流程


QQ圖片2.png



實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

待測樣本

待測序列信息

7周或以上

我們提供

基本實驗步驟、測序報告、圈點圖


實驗結果展示


圖片.png

            5.2待分析的目標片段PCR擴增電泳圖                       圖5.3菌落PCR篩選陽性克隆


QQ圖片.png

圖5.4三樣本的甲基化結果圈點圖分析

注:圖中有三個樣本,每個樣本含5個克隆測序結果,共計15個測序結果。每個圓圈代表一個CG位點,黑圈代表甲基化,白圈代表未甲基化;每一行代表一個樣本TA克隆的一個測序結果,序列中所有的CG位點情況可被被羅列,此例序列中共含有31個CG位點。


TROUBLSHOOTLNG


實驗問題

原因

推薦解決方法

基因組DNA電泳條帶彌散?

樣本降解

重新抽提基因組DNA

樣本重亞硫酸鹽修飾不充分?

修飾試劑及條

檢測試劑是否受潮結塊;適當延伸修飾轉化時間。

無法擴增到目的條帶?

PCR反應條件不佳

二次PCR、巢氏PCR、重新設計BSP引物。

TA克隆后篩選不到陽性克隆?

陽性克隆率過低

優化TA克隆條件,提高PCR目標片段的回收率,采用質量更好的感受態細胞和T載體。

測序結果中有大量非CpG的C?

甲基化修飾不完全

對待修飾的基因組DNA嚴格定量,按照甲基化修飾試劑盒說明書操作。



常用問題 FAQ


Q:常見的甲基化測定方法有哪些,優缺點是什么?

常見方法

優缺點

MSP法(Methylation-specific PCR,MSP):亞硫酸鹽處理基因組DNA,分別設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物,如果對甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。

無需挑克隆測序,步驟簡單,但對引物設計的要求較高,容易出現PCR假陽性,影響實驗結果分析。

BSP法(Bisulfite sequencing PCR ,BSP):亞硫酸處理基因組DNA,設計BSP引物擴增,將PCR產物克隆至T載體測序,分析CpG位點是否發生甲基化。

可明確樣本待測區段每個CG位點的甲基化程度;受實驗方法和價格因素限制無法高通量。

高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting ,HRM):重亞硫酸處理基因組DNA,未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增后轉變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變,導致樣品中的GC含量發生改變后溶解溫度變化,從而進行分析。

檢測方法高通量,但是無法明確每個CG位點的甲基化程度。


Q:BSP甲基化檢測的關鍵步驟有哪些?

A1)基因組DNA的重亞硫酸鹽修飾:轉化效率高低直接影響實驗結果,所以需在實驗過程中不斷摸索合適的實驗條件以確保較高的轉化效率;

2)BSP引物設計:我們對每個區段設計一到兩對引物,引物位置需盡可能的避開DNA中的CG位點,必要時需設計巢式引物,以擴增得到目標片段;

3)PCR擴增:對于較難擴增得到的目標片段,需調整PCR反應條件。


Q:為什么800bp的目標片段要分成2段進行BSP甲基化研究?

A由于基因組DNA被中亞硫酸鹽修飾后會發生斷裂,平均片段大小在500bp左右,所以每次擴增片段大小不能超過500bp


Q:客戶問:BSP甲基化擴增得到的PCR產物可否直接測序,為什么需要構建TA克隆后測序?

A由于基因組DNA的每個CG位點甲基化程度各不相同,C若未發生甲基化后會修飾成為U,而C若發生甲基化則不變,如果進行PCR產物測序就有可能在原有的C位點得到雙峰圖,無法確定甲基化的程度,必需通過回收PCR產物,進行TA克隆,隨機挑選5-10個單克隆測序的方式才能計算獲得每個CG位點的甲基化程度。


Q:如何對BSP甲基化測序結果進行分析?

A我們會采用專業甲基化分析軟件對各個TA克隆的測序結果進行分析,分析過程中可以了解到:

1) 測序序列與目的序列的相似度;

2) C-T轉化效率

3) 通過黑白圈點圖確認目的片段中每個CG是否發生甲基化;

4) 確認每個CG位點發生甲基化的比例。


Q :怎樣確定基因的目標區域來進行甲基化分析呢?

ABSP法甲基化檢測首先需要確定甲基化的檢測區域,由于甲基化與調控密切相關,因此我們可參考相關文獻對已知轉錄調控區的基因進行甲基化分析。如果轉錄調控區位置未知,可以通過基因組序列分析確定該基因的轉錄起始位點、翻譯起始密碼位置,并分析CpG島。轉錄起始位點附近的CpG島進行DNA甲基化分析的首選區域,一般位于啟動子或者5‘UTR區。需要說明的是,預測僅僅是找到可能性大的區域,我們不能保證預測出來得到區域肯定是有甲基化的。


Q:為什么文獻報導的甲基化序列不在CpG島中?

ACG二核苷酸是發生甲基化位點的主要區域,而CG富含區更是甲基化發生幾率更高的區域,但是沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化,甲基化也可能發生在并不密集的CG區域。


參考文獻

1. Li LC. Designing PCR primer for DNA methylation mapping. Methods Mol Biol 2007, 402:371-84.

2.Zhang Y, Rohde C,Tierling S, et al.DNA methylation analysis by bisulfite conversion,cloning, and sequencing of individual clones. Methods Mol Biol. 2009,507:177-87.

Q Q 客服
 
 
 
 
 工作時間
周一至周五 :9:00-18:00
 聯系方式
客服熱線:021-80158420
注:不用QQ的可點擊微信或網頁右側在線咨詢
微信咨詢

微信咨詢

副標題

 
 
 
 

肖祥.jpeg


         

滬公網安備 31011502005995號