銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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細胞免疫熒光檢測

immunofluorescence



實驗原理


細胞免疫化學與免疫組織化學實驗都是依據抗原抗體反應和化學顯色的原理,采用標記的特異性抗體對組織或細胞內抗原的分布進行原位檢測技術。細胞免疫化學將培養處理后的細胞爬片、固定、破膜、封閉后,加入一抗與抗原蛋白結合,再加入標記有熒光素的二抗與一抗進行反應,最后通過激光共聚焦掃描顯微鏡進行熒光拍攝來顯示細胞中靶蛋白的表達變化和定位。

激光共聚焦掃描顯微鏡(Confoccal Laser Scanning Microscope, CLSM)是現在最先進的細胞生物醫學分析儀器之一,采用激光作掃描光源,逐點、逐行、逐面快速掃描成像,掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡,物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點,也是瞬間成像的物點。從一個點光源發射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上,如果物體恰在焦點上,那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源,這就是所謂的共聚焦。由于激光束的波長較短,光束很細,所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力,大約是普通光學顯微鏡3倍。系統經一次調焦,掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時,就可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些圖像信息都儲于計算機內,通過計算機分析和模擬,就能顯示細胞樣品的立體結構。


技術應用


檢測靶蛋白如內分泌激素、蛋白質、多肽、核酸、神經遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物。


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

細胞株(凍存株或培養細胞)

及所需藥品,抗體

細胞培養信息和藥物處理方式

3周

我們提供

剩余藥品、抗體

基本實驗步驟、Confocal各色

熒光照片


實驗結果展示


圖1 細胞目的蛋白的confocal拍攝照片
A:細胞白光照片;B:標記紅色熒光的目的蛋白;C:標記綠色熒光的目的蛋白;
D:DAPI進行核染;E:A-D圖片的重疊圖片。


TROUBLESHOOTING

實驗問題

原因

推薦解決方法

熒光信號背景很高?

一抗質量不佳

選用特異性和效價更高的抗體。

抗體濃度太高

注意調整一抗和二抗的稀釋比例。

封閉不完全

改善封閉條件。

洗滌不充分

充分洗滌。

熒光信號較弱?

目的蛋白表達量過低

可以設置表達量較高的陽性細胞作為對照。

細胞破膜效果不佳

采用合適的通透劑或采用甲醇固定無需通透。

一抗稀釋度過大

需進行預實驗摸索一抗稀釋比例。

二抗選擇錯誤

使用能正確識別一抗的二抗。


常見問題FQA


Q:哪些熒光染料常用于細胞免疫熒光檢測?

熒光染料名稱

最大吸收光譜

最大發射光譜

異硫氰酸(Fluorescein lsothiocyanate, FITC)

490~495nm

520~530nm,呈翠綠色熒光

四甲基異硫氰酸羅丹明(Tetramethyl Rhodamine lsothiocyanate, TRITC)

550nm

620nm,橙紅色熒光

四乙基羅丹明(RB200)

570nm

595~600nm,呈橙紅色熒光

德克薩斯紅(Texas Red)

596nm

620nm,紅色熒光

CY3

544nm

568-574nm,呈鮮紅色熒光

碘化丙啶(Propidium lodide, PI)

493nm

630nm,呈紅色熒光

4’ ,6-e二脒基-2-苯基吲哚(4‘ ,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)

358nm

461nm,藍色熒光


Q:怎樣選擇二抗標記的熒光?

A :二抗標記的熒光顏色的選擇非常重要,要求在實驗前根據現有材料和儀器的局限性設計好實驗方案,一般我們進行三種顏色的標記工作。目前細胞核染料常用PI(紅色)或DAPI(藍色),如果細胞中還表達EGFP(綠色),則需要選用其他顏色的熒光素來標記目的蛋白,不得已的情況下采用顏色相近,后期也要用光譜拆分技術對圖片進行處理(需專業人員進行,不建議采用相近顏色)。


Q:怎樣選擇細胞免疫化學爬片所用的固定劑?

固定劑種類

原理

優點

缺點

應用對象

有機溶劑

(甲醇)

強烈脫水變性蛋白,并可溶解脂類物質產生通透效應

蛋白變性完全,對抗原的保存性好,能充分暴露出抗原,無需通透處理

不易保存細胞形態,細胞可能呈扁平狀

細胞結構抗原、酶類抗原

交聯劑

(多聚甲醛)

導致細胞內分子相互連接呈網狀結構,并維持在原位上

更易于保持細胞的結構

交聯產生的阻礙可能會降低細胞組分的抗原性,需要通透處理

細胞膜相關組分蛋白



Q:做細胞免疫熒光大概提供多少抗體合適?

A:細胞免疫熒光實驗我們需先進行預實驗采用普通熒光顯微鏡進行觀察,確認實驗條件后再進行Confocal拍攝的正式實驗。確認實驗條件后再進行Confocal拍攝的正式實驗。24孔板的細胞爬片在進行一抗37℃孵育時,一般加入200ul經BSA稀釋的一抗,其稀釋倍數需參考抗體說明書,如稀釋倍數為1:100則每張爬片需要2ul(進行細胞免疫熒光的一抗稀釋倍數要比WB的小)。注意提供的抗體量需滿足預實驗和正式實驗所需的量。


Q:激光共聚膠顯微鏡拍攝除用于細胞免疫熒光拍攝外還可以進行哪些檢測?

A:由于各種熒光標記探針的應用,通過對熒光探針分布和熒光強度的分析,Confocal實驗還可以用于進行細胞內游離鈣、線粒體膜電位、活性氧、細胞膜流動性、細胞結構等實驗結果的拍攝和分析工作。根據客戶對細胞處理的要求并且購買合適的探針試劑盒,我們也可以為您進行您實驗所需的Confocal拍攝工作。



參考文獻

1. Davia LS,R obert DG.Metho ds in Microscopy:Protocols And Concepts from Cells, a Laboratory Manual [M].CSHLPress,2006.

2. Douglas JT, Brooke TM. Cell imaging techniques: methods and protocols[M].Springer,2006.



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