銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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組織樣本處理

sample processing



組織樣本處理服務包含:石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片/涂片


技術原理


石蠟切片(paraffin section)是組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構,也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法,而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。活的細胞或組織多為無色透明,各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差,在一般光鏡下不易清楚區別出;組織離開機體后很快就會死亡和產生組織腐敗,失去原有正常結構,因此,組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡,而能清晰辨認其形態結構。

冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片。它實際上是以水為包埋劑,將組織進行冰凍至堅硬后切片的。在冰凍切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程,大大縮短了制片時間。同時,由于此法不需要經過脫水、透明和浸蠟等步驟,因而較適合于脂肪、神經組織和一些組織化學的制片,并作為快速切片的方法應用在臨床診斷


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特點


石蠟切片標本可以長期保存使用,為永久性顯微玻片標本。

冰凍切片制作過程較石蠟切片快捷、簡便,而多應用于手術中的快速病理診斷.組織變化不大,能很好保存脂肪,類脂等成分。能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類,特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。


石蠟切片(paraffin section)


組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構,也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法,而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。教學中,光鏡下觀察切片標本多數是石蠟切片法制備的。活的細胞或組織多為無色透明,各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差,在一般光鏡下不易清楚區別出;組織離開機體后很快就會死亡和產生組織腐敗,失去原有正常結構,因此,組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡,而能清晰辨認其形態結構。


(一)石蠟切片前的準備


  1. 切片刀。傳統的切片刀在使用之前,一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度,然后進行磨刀。現在也可以使用一次性刀片,可省去磨刀。

  2. 修整蠟塊:切去組織周圍過多的石蠟,一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊,兩邊必須平行。

  3. 蠟塊固定:修整好的蠟塊先固定在事先準備好的小方木塊或者金屬塊上,固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱,再將蠟塊底部烙熔,迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。

  4. 載玻片擦洗干凈后,在其表面涂上粘附劑(蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸),根據染色方法選擇不同的粘附劑。

  5. 準備好毛筆、鑷子、染色架。

  6. 調好展片器內水的溫度(45℃),有時也可以加些酒精到水中。


(二)蠟切片


  1. 將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊,固定蠟塊底座或蠟塊,調整蠟塊與刀至合適位置,刀刃與蠟塊表面呈5度角。

  2. 切片多使用輪轉式切片機,切片時,左手執毛筆,右手轉切片機轉輪,先修出組織塊。

  3. 調整切片機上的切片厚度為4~7μm,然后切片。

  4. 切片可以是單張,也可以是連續切片形成蠟帶

  5. 展片和撈片:

    (1)直接展片法:在載玻片上滴加幾滴蒸餾水,然后把切片鋪在小滴上面,用酒精燈在載玻片下面加熱,待完全展平,傾斜載玻片,倒棄多余水分,同時擺正切片。

    (2)溫水漂浮法:此法用展片機或者用恒溫水浴箱,先使水溫保持在45~50℃,用左手拿毛筆輕輕托起切片,用右手用眼科鑷子夾起切片的一角,正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上,動作要輕快,切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開,必要時可用眼科鑷輕輕拔開,然后撈片,并及時編號。

  6. 展好的切片在室溫下稍微干燥后,放在40℃恒溫烤箱中,小片組織30分鐘即可,大的需12~24小時,烤干備用。


(三)注意事項


  1. 切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進行切片。

  2. 修整蠟塊時要細心,看清楚組織在蠟塊中的位置,以免將需要的組織修掉。

  3. 連續轉動切片機的轉輪時,速度一定要均勻,不能時快時慢,以免切片厚薄不一。

  4. 使用輪轉式切片機切片時,是由下向上切,為得到定然整的切片,防止組織出現刀紋裂縫,應將組織硬、脆難切的部分放在上端,如皮膚應將表皮部分向上,腸胃等組織應將漿膜面面朝上。

  5. 用展片器展片時,水溫應根據使用的石蠟熔點進行了調整,一般低于石蠟熔點10~15℃;撈片的時候動作要輕、稍快。動作太大容易出現氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。

  6. 單個切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處;連續切片的粘片順序一般是從左到右,組織切片較小是,可以并列粘貼2~3條蠟帶。

  7. 烤片的溫度不宜過高;烤片的時間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后,才能烤片,否則容易產生氣泡影響染色和觀察。

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冰凍切片(frozen section)


冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片。它實際上是以水為包埋劑,將組織進行冰凍至堅硬后切片的。在冰凍切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程,大大縮短了制片時間。同時,由于此法不需要經過脫水、透明和浸蠟等步驟,因而較適合于脂肪、神經組織和一些組織化學的制片,并作為快速切片的方法應用在臨床診斷。

  1. 取材:  應盡可能快地采取新鮮的材料,防止組織發生死后變化。

  2. 速凍:  為了較好地保存細胞內的酶活性或盡快制成切片標本的需   要,一般在取材后就要立刻對組織塊進行速凍,使組織溫度驟降,縮短降溫的時間,減少冰晶的形成。  液氮速凍切片法是實驗室最常用的速凍切片方法。具體做法是將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(直徑約2cm),如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織,然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內,當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰,此時小盒保持原位切勿浸入液氮中,大約10-20s組織即迅速冰結成塊。在制成凍塊后,即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。若需要保存,應快速以鋁箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱貯存備用。

  3. 固定:  樣品托上涂一層OCT包埋膠,將速凍組織置于其上,4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。  取下組織置于錫箔或者玻片上,樣品托速凍。  組織置于樣品托上,其上再添一層OCT膠,以完全覆蓋為宜,速凍架(PE)上30min。

切片:  恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機,其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內,故切片時不受外界溫度和環境影響,可連續切薄片至5-10μm。切片時,低溫室內溫度以-15℃~-20℃為宜,溫度過低組織易破碎,抗卷板的位置及角度要適當,載玻片附貼組織切片,切勿上下移動。切好室溫放置30min后,入4℃丙酮固定5~10min,烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。進行抗原熱修復,微波熱修復也可,室溫自然冷卻。可用3%H2O2孵育5~10min,消除內源性過氧化物酶的活性。

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細胞爬片


就是讓玻片浸在細胞培養基內,細胞在玻片上生長,主要用于組織學,免疫組織化學,冰凍切片,細胞涂片,原位雜交等.

細胞爬片特點

1.玻片表面經過TC處理,雙面均可使用

2.γ射線滅菌,保證無菌.

3.使用便捷,只需打開包裝,將爬片放入孔板內,將細胞懸液滴到爬片上即可培養.

4.爬片厚度為0.17mm,直徑為8mm/14mm/20mm/25mm.分別適用于48孔細胞培養板/24孔細胞培養板/12孔細胞培養板/6孔細胞培養板

5.超強吸附:該玻片表面具有永久的陽離子電荷,可以通過靜電作用吸附冰凍切片組織或細胞,使之粘附在玻片上,進而在玻璃和切片組織之間形成共價鍵.因此,無需粘黏劑或者蛋白包被,該玻片也能牢固的粘附切片或細胞。

操作注意

使用細胞爬片時(比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面積往往會比爬片面積多出一部分,加細胞懸液時常常就是細胞鋪滿整個孔底,有時細胞生長邊集現象,就是靠近壁邊緣密度要高些,這樣處于中央玻片上爬的細胞數量就可能相對較少)

比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內后,加細胞懸液時只滴到玻片上,一直滴到液體布滿整個玻片又不會溢出玻片邊緣(因為液體表面張力作用可以很容易做到這一點!),放在培養箱里,等細胞貼壁后,取出,再滴加培養基布滿整個孔底,繼續培養,這樣玻片上的細胞生長的密度就會很集中.


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